同位素內(nèi)標技術(shù)是一種應(yīng)用廣泛的定量分析技術(shù)，它通過使用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標，來提高分析結(jié)果的精確度和準確度。同位素是指具有相同原子序數(shù)（即原子核中質(zhì)子的個數(shù)相同），但質(zhì)量數(shù)不同的原子核。同位素之間的差異主要體現(xiàn)在質(zhì)量上，因此同位素可以作為質(zhì)量標記物質(zhì)。
在同位素內(nèi)標技術(shù)中，同位素被用作參考物質(zhì)，通過與待測樣品進行比較，可以準確測量出待測樣品中目標物質(zhì)的含量。這種技術(shù)利用了同位素標記化合物的特殊性質(zhì)，將標準品（同位素內(nèi)標物）與分析樣品混合。這些同位素內(nèi)標物與對應(yīng)的未標記物（即目標分析物）在物理化學性質(zhì)上相似，但在質(zhì)譜檢測中能夠產(chǎn)生顯著的差異，從而允許研究人員準確地區(qū)分并定量目標分析物。
1、內(nèi)標物的選擇
純度與豐度：同位素內(nèi)標物的純度一般應(yīng)≥98%，常以色譜純度衡量，如LCMS/MS、GCMS、HPLC等方法，若產(chǎn)品吸收或MS信號較弱，也可使用NMR檢測等。同位素產(chǎn)品的豐度也應(yīng)≥98%。
穩(wěn)定性：選擇化學性質(zhì)穩(wěn)定、不易發(fā)生分解或化學反應(yīng)的同位素內(nèi)標。例如，13C和15N標記的化合物穩(wěn)定性較好，而活潑氘（2H）取代的同位素產(chǎn)品在某些情況下可能不穩(wěn)定，如氨基、羧基、羥基上的氫被氘取代的內(nèi)標，這些活潑氘極易被交換為氫，除非實驗有特殊需求，一般不選擇此類內(nèi)標。
結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似性：理想的同位素內(nèi)標應(yīng)與分析物具有相似的化學結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)和色譜行為，這樣在樣品處理和分析過程中才能與分析物有相似的反應(yīng)和表現(xiàn)，減少誤差。例如，在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析中，內(nèi)標與分析物應(yīng)具有相近的保留時間、離子化效率和質(zhì)譜響應(yīng)特性。
基質(zhì)效應(yīng)：考慮基質(zhì)對內(nèi)標和分析物的影響，盡量選擇受基質(zhì)效應(yīng)影響小的內(nèi)標。如果無法避免基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)選擇與分析物受基質(zhì)效應(yīng)影響相似的內(nèi)標，以便準確校正?？梢酝ㄟ^實驗比較不同內(nèi)標在基質(zhì)中的表現(xiàn)，選擇適合的內(nèi)標。
2、內(nèi)標濃度的確定
交叉信號：內(nèi)標對分析物的信號貢獻不應(yīng)超過定量下限響應(yīng)的20%，分析物對內(nèi)標的信號響應(yīng)不超過內(nèi)標響應(yīng)的5%。當內(nèi)標和分析物之間存在干擾和交叉信號時，不合適的內(nèi)標濃度可能導致標準曲線非線性，影響定量結(jié)果的準確性。對于無干擾和交叉信號的情況，內(nèi)標濃度建議在40%ULOQ以上；對于有干擾但可接受的情況，內(nèi)標濃度建議為70%ULOQ濃度以上。
檢測靈敏度：根據(jù)分析方法對內(nèi)標和分析物的檢測靈敏度來確定內(nèi)標濃度。當內(nèi)標靈敏度較高時，其濃度可以相對較低；反之，則應(yīng)使用高濃度的內(nèi)標以保證足夠的信噪比，減少隨機噪聲的影響。
基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)效應(yīng)會影響內(nèi)標和分析物的響應(yīng)信號，因此內(nèi)標濃度的選擇應(yīng)盡量模擬分析物在基質(zhì)中的濃度。一般來說，一個合格的標曲范圍上1/3到2/3的濃度區(qū)間段很重要，基本能覆蓋實際要檢測的樣品濃度，所以在選擇內(nèi)標濃度時，應(yīng)盡可能參考實際樣品中分析物的濃度范圍。
3、實驗操作過程
準確添加：在樣品前處理過程中，要準確、精確地添加內(nèi)標，確保內(nèi)標與樣品充分混合均勻?？梢允褂靡埔浩鳌⒓訕悠鞯染軆x器進行添加，并嚴格按照操作規(guī)程進行操作，避免因操作不當導致內(nèi)標添加量不準確或混合不均勻。
避免污染：防止內(nèi)標受到污染，因為即使是微量的污染物也可能影響內(nèi)標的純度和準確性，進而影響分析結(jié)果。在儲存、使用和處理內(nèi)標的過程中，要保持環(huán)境的清潔衛(wèi)生，使用干凈的容器和試劑，避免與其他物質(zhì)接觸。
穩(wěn)定性監(jiān)測：定期監(jiān)測內(nèi)標的穩(wěn)定性，確保其在儲存和使用過程中沒有發(fā)生降解、分解或其他變化。可以通過分析內(nèi)標的色譜圖、質(zhì)譜圖、信號強度等參數(shù)來判斷其穩(wěn)定性，如果發(fā)現(xiàn)內(nèi)標不穩(wěn)定，應(yīng)及時更換新的內(nèi)標溶液。
4、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析
校正因子的確定：通過分析已知濃度的標準樣品，確定內(nèi)標對分析物的相對響應(yīng)因子（校正因子），用于校正分析物在不同樣品中的含量。校正因子的準確性直接影響定量結(jié)果的準確性，因此在建立分析方法時應(yīng)仔細測定校正因子，并在實際樣品分析中正確應(yīng)用。
質(zhì)量控制：在數(shù)據(jù)分析過程中，要進行質(zhì)量控制，檢查內(nèi)標和分析物的信號強度、峰形、保留時間等參數(shù)是否符合要求，剔除異常數(shù)據(jù)。同時，可以使用標準曲線、回收率試驗、精密度試驗等方法評估分析方法的準確性和可靠性。
結(jié)果解釋：在解釋分析結(jié)果時，要考慮內(nèi)標的使用情況和可能存在的誤差來源。由于同位素內(nèi)標法是一種相對定量方法，分析結(jié)果通常以相對于內(nèi)標的含量或濃度表示，因此在比較不同樣品或不同批次的分析結(jié)果時，要注意內(nèi)標的差異和實驗條件的一致性。
